Ryba w laboratorium

Badania w dziedzinie biologii nie byłyby możliwe bez prowadzenia eksperymentów na żywych organizmach. Ta praktyka dotyczy także ryb, o czym wielokrotnie mogliście się przekonać czytając ten blog. Często prowadzi się badania polegające na obserwacji ciekawych zachowań, na przykład reakcji na obecność lustra, albo strategii rozrodczych. Inne cele przyświecają badaniom reakcji wybranych gatunków modelowych na zmiany środowiska, lub poznawaniu meandrów ewolucji i relacji rodzinnych w grupach gatunków. Osobną gałęzią badań z wykorzystaniem ryb (i zwierząt w ogóle) jest poznawanie mechanizmów molekularnych, czyli działania organizmów, tkanek oraz komórek, jak również badanie zaburzeń tych mechanizmów. Do tego celu wykorzystuje się gatunki łatwe w hodowli, a nie zaszkodzi jeśli mają jakieś specjalne właściwości. Bywa też, że zwierzęta takie hoduje się w celu wzmocnienia pewnych cech, na przykład istnieją rody szczurów, które mają silne skłonności do nowotworzenia. Coraz częściej zwierzęta laboratoryjne poddawane są celowanym modyfikacjom genetycznym nadającym im specjalnych właściwości niezbędnych do realizacji zadań badawczych.

Pośród ryb jednym z najpowszechniejszych gatuków laboratoryjnych jest doceniany także przez akwarystów, naturalnie występujący w południowej Azji, danio pręgowany, Danio rerio, po angielsku zwany Zebrafish. Wybór tego gatunku nie był zupełnie przypadkowy, gdyż jest to rybka niewielka i łatwa w hodowli, rozwój przejrzystego zarodka trwa 42 godziny, a po 4 miesiącach życia rybki zabiera się do rozmnażania.

Danio rerio forma dzika. Zdjecie pochodzi z serwisu akwariumdomowe.pl

Już w latach 20. ubiegłego wieku biolodzy doceniali danio jako dobry model do badań, jednak dopiero w latach 60. powstał na Uniwersytecie Oregon ośrodek specjalizujący się w hodowli i badaniach tej ryby, Zebrafish International Resource Center (ZIRC) . W tym ośrodku sklonowano Danio jako jednego z pierwszych klonowań kręgowców (1981). Wykorzystując doświadczenie i hodowlane linie z Oregonu, od lat 90 prowadzono na całym świecie liczne doświadczenia oparte na indukcji losowych mutacji, a brytyjski Instytut Sangera uzyskał w 2011 roku kompletną sekwencję DNA tych ryb.

Zebrafish Genome Project i liczne szczepy mutantów o interesujących właściwościach umocniły pozycję tego gatunku wśród biologów molekularnych. Trudno jest policzyć w jak wielu pracach badawczych z tej obszernej dziedziny posługiwano się danio, ale odkąd stały się osiągalne techniki precyzyjnej edycji genów (CRISPR/Cas9), lista tych prac wydłuża się w postępie geometrycznym.

Czteromilimetrowej długości larwy danio. U góry dzika forma, na dole mutant Bleached Blond. Wikimedia

Posłużę się tylko jednym przykładem, który pozwoli wam uzmysłowić sobie postęp medycyny związany z modyfikacjami genetycznymi zwierząt laboratoryjnych.
Kilka miesięcy temu ogłoszono sukces w leczeniu rzadkiej choroby genetycznej, która dotknęła pewnego chłopca z USA. Po ukończeniu 10 roku życia ten młody piłkarz zaczął słabnąć. Jego kończyny puchły jak gąbki, płuca i jama osierdzia wypełniały się płynem, dzieciak po dwóch latach choroby żył jedynie dzięki stałemu podłączeniu do aparatury medycznej, a jego stan systematycznie się pogarszał. Wszystko przez mutację w genie ARAF odpowiedzialną za nadmierny wzrost i nieszczelność naczyń limfatycznych. Co ciekawe, mutacja ta nie została odziedziczona, tylko spontanicznie powstała na wczesnym etapie życia płodowego chłopca. Ponieważ gen ten jest zlokalizowany na chromosomie X, nie było możliwości skompensowania błędu, bo jako chłopiec, dysponuje on tylko jednym takim chromosomem.

Po dwóch latach nierównej walki z chorobą chłopiec trafił na oddział paliatywny i tylko dr Hakonarson z Filadelfii odważył się walczyć, chociaż czasu było bardzo mało. Przeprowadził on modyfikację genetyczną Danio, wczepiając do zapłodnionych jaj gen ARAF z defektem jaki stał się przyczyną choroby chłopca. Ród powstałych w ten sposób ryb ujawniających objawy choroby, traktowany był rozmaitymi lekami, by w jak najkrótszym czasie znaleźć cień szansy na odwrócenie skutków mutacji. I takim lekiem okazał się lek stosowany w terapii zaawansowanego czerniaka, trametinib. Wniosek Hakonarsona przeszedł procedury prawne i FDA zezwoliło na podjęcie terapii u chłopca. Po trzech miesiącach pacjent nie wymagał już maski tlenowej, a dwa lata po kuracji jego układ limfatyczny funkcjonuje niemal normalnie, zaś chłopiec wrócił do aktywności sportowej.

Produkt inżynierii genetycznej. Młodociany osobnik, którego tkanki świecą światłem w różnych barwach. © Paquet Rockefeller University

Łatwość obserwowania rozwoju zarodkowego i larwalnego Danio dała tej rybce ogromną wartość naukową w badaniach embriologicznych i histologicznych. Także w tych przypadkach posłużono się modyfikacjami genetycznymi i to w zakresie który wzbudziłby bezbrzeżny podziw u biologów sprzed kilku dekad. Otóż do genomu Danio wmontowano geny kodujące białka fluoroscencyjne i uczyniono to z taką precyzją, że różne tkanki są wybarwione na rozmaite kolory. Dzięki temu można rejestrować nie tylko stany, które wymagają zabicia zwierzęcia, ale obserwuje się procesy w czasie rzeczywistym, podążając za procesem rozwojowym danego osobnika, nawet jeśli wymaga to anestezji i obserwacji pod mikroskopem. Można też sprawdzać jaki dokładnie wpływ na rozwój organizmu wywierają rozmaite lekarstwa bądź toksyny*.

Brainbow zebrafish. Odmiana w której barwniki ujawniają się w towarzystwie wybranych białek charakterystycznych dla różnych struktur mózgowych.

Wspomniałem wyżej, że na atrakcyjność organizmu modelowego mają wpływ także moce specjalne, którymi ewolucja obdarzyła dany gatunek. Do sukcesu danio dołożyła się zdolność do regeneracji układu nerwowego, serca, a także np. płetw. Możliwość obserwowania na żywo sekwencji zdarzeń: podziałów i migracji komórek w odtwarzającym się narządzie, jak również łatwość identyfikacji włączanych i wyłączanych genów jest w tych dziedzinach nauki nie do przecenienia.

Stworzono również taką odmianę danio, która produkuje fluorescencyjne białka w trzech podstawowych kolorach w skórze. Co więcej – każdy z tych kolorów ulega ekspresji na losowym ale stałym poziomie, więc ryba działa jak wyświetlacz RGB z komórkami w roli pikseli. Naukowcy z Duke University, którzy opracowali tę metodę, zaobserwowali 70 różnych kolorów, ale wierzę że liczba odcieni będzie wzrastać 😉

Danio skinbow oraz powiększenie komórek jego skóry. Wikimedia

Ta barwna mozaika pozwala obserwować co dzieje się podczas leczenia urazów, gdy komórki przemieszczają się oraz dzielą na potęgę by załatać ranę. W przyszłości będzie można korzystać z dobrodziejstw przyspieszonej regeneracji lub hodować narządy zamienne. I ta mała, niedorzecznie kolorowa rybka, danio pręgowany odmiany skinbow, będzie miała swój mały udział w tym cudzie.

Genetyczna modyfikacja białkami fluorescencyjnymi, w swojej pierwszej edycji z 1999 roku**, zaowocowała także sukcesem komercyjnym. Na początku XXIw. zarejestrowano „glo-fish”, czyli świecącą w ciemności odmianę Danio jako rybę akwarystyczną i od tego czasu bywa spotykana w domowych akwariach na całym świecie. Mały problem z hodowlą tych rybek polega na tym, że partnerzy nie zmodyfikowani stosują wobec nich politykę apartheidu i zwyczajnie nie chcą się trzeć. Na szczęście krzyżówki glo-fish x glo-fish zachodzą bez przeszkód.

Tomasz Kijewski

Warianty akwarystycznej odmiany glo-fish . Akwa-mania.mud

* Zastanawialiście się kiedyś, dlaczego na tak dużej liczbie leków widnieje zakaz podawania dzieciom? Otóż właśnie dlatego, że istnieje niebezpieczeństwo zaburzenia procesów towarzyszących dorastaniu, a mało kto prowadzi badania kliniczne z udziałem dzieci.

** Odmiana Glo-fish powstała w Singapurze

Jeśli chcesz wiedzieć więcej:

D. Li i inni: ARAF recurrent mutation causes central conducting lymphatic anomaly treatable with a MEK inhibitor; Nature Medicine 2019

K. Koltowska: A zebrafsh genetic model enables an invaluable discovery: a lifesaving treatment for a lymphatic anomaly; Lab Animal, Nature 2019

N.G. Holtzman i inni: Learning to Fish with Genetics: A Primer on the Vertebrate Model Danio rerio; Genetics 2016

J. Bradbury: Small Fish, Big Science; PLOS Biology 2004

O danio i jego roli w nauce można napisać znacznie więcej i pewnie jeszcze wrócę do tego tematu. Bądź co bądź, pubmed wyświetla ponad 10000 publikacji na pytanie „zebrafish model”. Niecierpliwym polecam ten wpis.

Zdjęcie w nagłówku przedstawia pokój hodowlany w Basic Sciences division at the Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) in Seattle, Washington i pochodzi z notki blogowej Andrew Mathewsona